肺间质纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶的动态改变
肺间质纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶的动态改变
肺间质纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶的动态改变
中华结核和呼吸感染 1999年第2期第0卷 论著
作者：刘新民 许松 何冰 谭伟
单位：100034 北京医科大学附属第一医院呼吸内科(刘新民、何冰、谭伟)，中心实验室(许松)
关键词： 基质金属蛋白酶；肺纤维化；巨噬细胞
【摘要】 目的 进一步评价基质金属蛋白酶(MMP)在肺间质纤维化形成过程中的作用。方法Wistar大鼠21只随机分为模型组14只，对照组7只，模型组在额镜直视下插管，注入0.4%博莱霉素注射液5 mg/kg，制成动物模型。观察注射药物后1周和4周肺泡巨噬细胞和成纤维细胞MMP的活性及表达。利用空斑扩散法，测定胶原酶活性。结果 正常肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性很低，分别为20.4× U/细胞和30.6× U/细胞，动物模型1周、4周组，肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性明显增加。肺巨噬细胞1周达高峰(258.0× U/细胞)，成纤维细胞4周达高峰(289.0× U/细胞)；正常肺组织MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA表达很低，动物模型1周,4周组，MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA表达较对照组增加，4周组较1周组略有降低。结论 MMP在肺间质纤维化形成早期肺泡炎阶段及后期纤维化形成阶段均起重要调节作用。
Effects of metalloproteinases on pulmonary fibrosis by bleomycin in rats LIU Xinmin, XU Song, HE Bing, et al. Respiratory Department of the First Teaching Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective Matrix metalloproteinases (MMPs) are the mediators for dynamic equilibrium of extracellular matrix. The purpose was to investigate the effects of metalloproteinases on the development of pulmonary thods The expression and activity of metalloproteinases of alveolar macrophage, and fibroblasts were evaluated on rats with pulmonary fibrosis induced by sults The activity of collagenase was low in the macrophage and fibroblast in control group, 20.4× U/cell and 30.6× U/cell respectively. There was an increase in the first and fourth week groups of bleomycin rats. The highest level of activity of alveolar macrophages was 258.0× U/cell in first week group. A peak of enzymatic activity was found in 4th week group (289.0× U/cell). The mRNA of MMP-1, MMP-2 were expressed at lower levels in the normal lung tissue and there was an increase in first week, and fourth week group of bleomycin rats with a peak in one week nclusions The regulation of metalloproteinases might play an important role in the development of pathological processes in pulmonary fibrosis.
【Key words】 Metalloproteinases Pulmonary fibrosis Macrophages
肺间质纤维化是许多种慢性肺部疾病的病理过程，是肺内细胞与细胞外基质（ECM）相互作用的结果，最终导致ECM的某些成分在肺内过度沉积，这种病理改变是由于ECM的代谢紊乱所致。基质金属蛋白酶（MMP）是一组锌离子依赖酶，在ECM代谢的调节中起着非常重要的作用。为了进一步评价基质金属蛋白酶在肺间质纤维化形成中的作用，我们利用博莱霉素致大鼠肺间质纤维化模型，观察了肺间质纤维化形成过程中基质金属蛋白酶的动态改变，现将结果报道如下。
材料与方法
一、动物模型的制备
雄性Wistar大鼠21只,体重(250±20) g，随机分为模型组14只，对照组7只，模型组在额镜直视下气管插管，注入0.4%博莱霉素注射液（5 mg/kg）,制成动物模型，然后分为1周组、4周组，分别于7、28天处死。
二、细胞培养
经气管插管、肺灌洗、离心收集巨噬细胞。贴壁纯化、计数、原代培养48小时，收集上清。肺组织经胰蛋白酶消化、过滤、离心，纯化分离肺成纤维细胞，计数，原代培养，收集上清，分别进行巨噬细胞、和成纤维细胞所分泌胶原酶蛋白活性测定。
三、胶原酶活性的测定［1］
肺泡巨噬细胞、成纤维细胞胶原酶利用空斑扩散法，测定胶原酶蛋白活性。2%的琼脂糖与0.4胶原蛋白加热混匀，制成凝胶板，打孔。用缓冲液稀释一系列不同浓度的胶原酶，加20 μl于孔内，孵育72 h，考马斯亮蓝染色，脱色后观察扩散圈直径，制作标准曲线。样品用胰蛋白酶，大豆蛋白酶抑制剂处理后取20 μl入孔，测定胶原蛋白酶的活性。
四、基质金属蛋白酶（MMP）-1、2 m-RNA的表达
MMP-1，美国华盛顿大学Jolla教授惠赠，质粒blue script vectors, 插入片段1 900 bp, 酶切位点Small Ⅰ。 MMP-2相对分子质量为72×103, 质粒PBR322, 插入片段为2.65 kb, 酶切位点Hand Ⅲ, 来源于芬兰大学 Tryssvaswa教授, 利用一步法（AGPC）［2］，提取肺组织RNA进行Northern杂交［3］，放射自显影，杂交带密度扫描积分，以与β-actin之比表示相对含量。
结果
一、肺细胞胶原酶活性测定
正常肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性很低，动物模型1周、4周组，肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性明显增加。肺巨噬细胞1周达高峰，成纤维细胞4周达高峰(图1)。
图1 肺间质纤维化大鼠模型不同时期肺细胞胶原酶的活性测定
二、肺组织MMP-1、2 m-RNA的表达
Northern杂交结果显示，对照组肺组织无MMP-1、2 m-RNA的表达。MMP-1、MMP-2 m-RNA肺损伤1周时表达增加，4周时MMP-1 、MMP-2 m-RNA持续稳定的表达（图2）。
图2 大鼠肺组织MMP-1、MMP-2 mRNA的表达
讨论
肺间质纤维化的形成是许多慢性肺疾病的结局。这些慢性肺疾病无论何种起因，其共同的病理特点是长期慢性肺部炎症导致肺泡持续性损伤、细胞外基质的破坏与修复反复进行。基质金属蛋白酶调节细胞外基质的代谢，对于这些病理过程具有重要的作用。MMP-1包括间质胶原酶-1及中性粒细胞胶原酶，中性粒细胞胶原酶其作用底物主要是间质性胶原I型，间质胶原酶-1的作用底物是间质胶原Ⅲ型［4］。IV型胶原酶即MMP-2, 其自然底物主要是IV型胶原分子［5］，对纤维连接蛋白（Fn）也有一定的作用。MMP-2在肺损伤与修复过程中对基底膜的损伤与重塑起重要的调节作用。我们利用博莱霉素致大鼠肺间质纤维化模型，观察了肺损伤与修复过程中MMP-1、 MMP-2在肺组织中的表达，发现正常肺组织MMP-1、 MMP-2几乎不表达，在肺损伤的早期，即肺泡炎阶段，MMP-1、 MMP-2的表达明显增加，在肺损伤后期MMP-1、 MMP-2较早期有所降低，但仍然表达很高。说明无论在肺损伤早期或后期细胞外基质代谢都异常活跃。肺间质纤维化的形成与细胞外基质的代谢紊乱有关。主要表现为合成代谢的异常活跃，而并非降解减少。Connor等［6］认为在纤维化形成过程中，总的基质金属蛋白酶(MMPs)在早期的损伤阶段参与了细胞外基质和基底膜的降解，在后期的修复阶段对肺组织结构的重塑起重要的调节作用。
基质金属蛋白酶的活性与表达受许多细胞因子的调控。如白细胞介素1(IL-I)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板源性生长因子(PDGF)等能上调基质金属蛋白酶的表达，而转化生长因子β(TGF-β)、γ-干扰素、IL-4能下调基质金属蛋白酶的表达［7］。基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）能有效地抑制MMPs的活性，从而参与调节细胞外基质的代谢。TIMP/MMPs与肺间质纤维化的发生、发展密切相关［8］。
肺内许多细胞如肺泡巨噬细胞、肺成纤维细胞以及肺血管内皮细胞等都能分泌胶原酶。我们观察了肺泡巨噬细胞和成纤维细胞在肺损伤与修复的不同阶段胶原酶的活性，发现正常的肺泡巨噬细胞、成纤维细胞胶原酶的活性很低，肺损伤的早期，肺泡巨噬细胞、成纤维细胞胶原酶的活性迅速增加。肺泡巨噬细胞胶原酶的活性达高峰，肺损伤的后期成纤维细胞胶原酶的活性占明显的优势。因此，我们认为肺胶原酶在早期的肺损伤阶段主要来自肺内的炎性细胞，如中性粒细胞，巨噬细胞，而后期主要来自肺组织细胞，如成纤维细胞，血管内皮细胞等 。
本课题受卫生部基金资助(基金编号)
参考文献
1 Harris ED, Vater CA. Vertebrate collagenase. In:Cunningham LW ed. Methods in enzymology. Vol 82. New York: Acod Press, 1982. .
2 Chomaynoki P, Saochi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate phenol chlororoform extraction. Anal Biochem, 1987,162:.
3 Sabrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York：Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989.
4 Mallya SK, Mookhtiar KA, Gao Y, et al. Characterization of 58-kilodalton human neutrophil collagenase: comparison with human fibroblast collagenase. Bochemistry，1990，289: .
5 Liotta LA, Trvggvason K, Garbisa S, et al. Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collage. Nature，1980，284:.
6 Connor, CMO, FitzGerld MX. Matrix metalloproteases and lung disease. Thorax，1994，49:.
7 Wilder RL, Lafyatis R, Roberts AB, et al. Transforming growth factor in rheumatoid arthritis. Ann NY Acad Sci 1990,593:.
8 Roman JR, McDonal JA. Cellular processes in lung repair. Chest，1991，100：.
(收稿： 修回：)